Malaria Journal volume 21, Numero articolo: 259 (2022 ) Cita questo articoloLa resistenza antimalarica rimane un'importante sfida per la salute pubblica in Cambogia.L'efficacia di tre terapie per la malaria falciparum non complicata è stata valutata nella provincia di Oddar Meanchey nella Cambogia settentrionale dal 2009 al 2011.In questo studio randomizzato, in aperto, controllato a gruppi paralleli, 211 soggetti di almeno 5 anni con malaria falciparum non complicata sono stati trattati con 3 giorni di terapia osservata direttamente: 63 hanno ricevuto artesunato-meflochina (AS/MQ), 77 hanno ricevuto diidroartemisinina– piperachina (DHA/PPQ) e 71 hanno ricevuto atovaquone–proguanile (ATQ/PG).I soggetti sono stati seguiti per 42 giorni o fino a recidiva di parassitemie.La genotipizzazione di msp1, msp2 e glurp tra i singoli isolati di parassiti ha distinto la recrudescenza dalla reinfezione.Il numero di copie Pfmdr1 è stato misurato mediante PCR in tempo reale e le concentrazioni inibitorie semimassime del parassita (IC50) sono state misurate in vitro mediante un test di incorporazione dell'ipoxantina isotopica di 48 ore.L'efficacia aggiustata per PCR per protocollo (intervallo di confidenza al 95%) a 42 giorni era 80,6% (70,8–90,5%) per AS/MQ, 97,2% (93,3–100%) per DHA/PPQ e 92,9% (86,1– 99,6%) per ATQ/PG.Il giorno 3, il 57,9% è rimasto parassitaemico nei bracci AS/MQ e DHA/PPQ.Al basale, il 46,9% presentava una gametocitemia microscopica da Plasmodium falciparum.Entrambe le recidive nel braccio DHA/PPQ hanno perso l'amplificazione del numero di copie Pfmdr1 alla recrudescenza.Tutte e quattro le recidive nel braccio ATQ/PG erano di tipo selvaggio per il citocromo bc1.Un soggetto si è ritirato dal braccio ATQ/PG a causa di allergia ai farmaci.Questo studio è stato condotto nell'epicentro di una sostanziale resistenza multifarmaco emersa subito dopo.All'inizio della transizione nazionale da AS/MQ a DHA/PPQ, sia DHA/PPQ che ATQ/PG avevano un'efficacia accettabile contro la malaria falciparum non complicata.Tuttavia, l'efficacia di AS/MQ era solo dell'80% con un'apparente resistenza alla meflochina basata sull'elevato numero di copie Pfmdr1 e IC50.Nel 2009 c'erano già prove significative di resistenza all'artemisinina non precedentemente segnalate al confine tra Cambogia settentrionale e Thailandia.Questo studio suggerisce le basi per lo sviluppo precoce di significativi fallimenti DHA/PPQ entro 3 anni dall'introduzione.È probabile che la resistenza all'artemisinina si sia verificata al confine settentrionale in concomitanza con quella segnalata lungo il confine occidentale a Pailin.Registrazione dello studio Questo studio legacy è stato condotto prima dei requisiti dell'International Committee of Medical Journal Editors per la preregistrazione su ClinicalTrials.gov.È stato fornito il protocollo completo.La diffusione del Plasmodium falciparum resistente ai farmaci ha complicato gli sforzi per controllare la malaria.Ciò può portare a una mortalità non necessaria se i farmaci inefficaci rimangono lo standard di cura dopo che i ceppi resistenti ai farmaci si sono stabiliti [1, 2].Nel sud-est asiatico, la resistenza è comune a più farmaci antimalarici tra cui clorochina (CQ), sulfadossina-pirimetamina, chinino (QN) e meflochina (MQ) [3].Dato il peggioramento della situazione, i paesi della regione hanno adottato la terapia combinata a base di artemisinina (ACT) a ciclo breve come trattamento di prima linea per la malaria da P. falciparum non complicata.In Cambogia, le attuali linee guida del Ministero della Salute sono tornate all'uso dell'artesunato-meflochina (AS/MQ) come terapia di prima linea per la malaria da P. falciparum non complicata [4].Ciò ha seguito diversi anni in cui la diidroartemisina-piperachina (DHA/PPQ) aveva sostituito AS/MQ a causa della diffusa resistenza clinica a quest'ultima e dell'evidenza di modelli di resistenza inversa alle due combinazioni a base di artemisinina [5].La meflochina è stata introdotta per la prima volta lungo il confine tra Thailandia e Cambogia nel 1983 [6].Nel 1994, AS/MQ è diventato il primo ACT utilizzato lungo il confine tra Thailandia e Myanmar a causa della crescente resistenza MQ [7].Nel 1995, AS/MQ è diventata la terapia di prima linea per la malaria falciparum non complicata in Thailandia, seguita dalla Cambogia nel 2000 [6].Nel 2003, significativi fallimenti clinici di AS/MQ sono stati documentati a Trat, Thailandia [8], poi nella vicina provincia cambogiana occidentale di Pailin nel 2002 e nel 2004 [9].A Chumkiri, una provincia della Cambogia meridionale lontana dal confine con la Thailandia, è stato osservato un tasso inaccettabilmente basso di risposta clinica e parassitologica adeguata (ACPR) per AS/MQ nel 2006-2007 [10].A causa dell'aumento dei tassi di fallimento AS/MQ, la Cambogia occidentale ha adottato DHA/PPQ nel 2008, seguita dal resto del paese nel 2012 [11].Poco dopo che sono stati segnalati errori significativi di DHA/PPQ nella provincia di Oddar Meanchey [12], la Cambogia è tornata ad AS/MQ nelle regioni in cui sono stati segnalati errori significativi di DHA/PPQ con un basso numero di copie Pfmdr1 [13].Il Ministero della Salute cambogiano ha adottato misure significative per contenere la possibile diffusione di P. falciparum resistente ad AS/MQ.In collaborazione con l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e la Fondazione Gates, il Ministero della Salute ha progettato un programma per confermare la presenza di resistenza all'artemisinina e per contenerne la diffusione.Il piano ha definito zone di contenimento ed eliminazione di Fase 1 e Fase 2 (Fig. 1), comprese le aree in cui è stato documentato un guasto significativo di AS/MQ (Fase 1).Si pensava che le aree di fase 2 adiacenti alla fase 1 fossero a rischio più elevato.Mappa della Cambogia con le Zone di Fase 1 e 2.Sito dello studio del 2009 in relazione alle zone di contenimento della malaria precedentemente stabilite 1 e 2. La zona 1 era considerata il rischio più alto ed era già passata all'uso di DHA/PPQ.Inoltre, sono state monitorate attività di screening e trattamento di massa utilizzando ATQ/PG per casi di malaria subclinica da P. falciparum identificati mediante PCRNell'area di contenimento di fase 1, AS/MQ è stato sostituito da DHA/PPQ come terapia di prima linea per la malaria da P. falciparum non complicata.L'efficacia e la tollerabilità di DHA/PPQ sono state precedentemente riviste nel 2007 [5] con 14 studi che hanno coinvolto 2.636 pazienti con malaria falciparum non complicata con tassi di guarigione a 28 giorni del 97-98%.La terapia è stata ben tollerata con eventi avversi comuni di nausea, vomito, anoressia, mal di testa, vertigini, diarrea e dolore addominale che si sono verificati nell'1-10% dei soggetti, in particolare anche sintomi comuni della malaria.Non sono stati segnalati eventi avversi gravi.Il successo del programma di contenimento dipendeva dalla misura in cui la resistenza all'AS/MQ si era già diffusa oltre la zona di contenimento di Fase 1 e dalla continua efficacia di DHA/PPQ e ATQ/PG nel trattamento di P. falciparum non complicato nella Fase 2 zona di contenimento.Nel 2008, l'OMS ha identificato ATQ/PG come l'unico antimalarico realistico non a base di artemisinina, che all'epoca non era mai stato utilizzato in Cambogia [14].Al momento dello studio, il Ministero della Salute ha condotto una campagna di screening e trattamento su larga scala nelle zone di Fase 1 utilizzando la PCR per la diagnosi di infezioni inapparenti e la terapia con atovaquone-proguanile (ATQ/PG).In studi precedenti, NAMRU-2 ha identificato i siti a rischio di resistenza all'AS/MQ esaminando circa 700 campioni di parassiti da casi di malaria falciparum non complicata da 5 province all'interno e all'esterno delle zone di contenimento per la prevalenza del gene Pfmdr1 amplificato.Le amplificazioni in questo locus sono fortemente associate alla resistenza in vivo alla meflochina [15].Il numero medio di copie Pfmdr1 più alto (~ 2,5) è stato trovato, non sorprende, a Chumkiri, il sito nel sud della Cambogia dove NAMRU-2 aveva precedentemente identificato una resistenza significativa ad AS/MQ [10].I siti nella Cambogia orientale, al di fuori di entrambe le zone di contenimento, avevano un numero medio di copie Pfmdr1 < 1,5, ma un sito nella zona di contenimento 2, Trapeang Prasat, provincia di Oddar Meanchey, aveva un numero medio di copie Pfmdr1 elevato (~ 2), suggerendo un rischio di AS /MQ resistenza (dati non pubblicati).Questo studio è stato intrapreso nel 2009 per valutare l'efficacia in vivo di AS/MQ, DHA/PPQ e ATQ/PG in questo sito, seguendo le linee guida raccomandate dall'OMS e dal Worldwide Antimalarial Resistance Network (WWARN) [16, 17].Questo studio era uno studio controllato randomizzato, in aperto, a gruppi paralleli, che valutava l'efficacia di 3 regimi antimalarici standard per il trattamento della malaria falciparum non complicata.Lo scopo era valutare l'efficacia terapeutica del trattamento di prima linea (AS/MQ) al momento dello studio in aggiunta ai suoi potenziali sostituti (DHA/PPQ e ATQ/PG) per guidare il processo decisionale e la politica, come descritto in Linee guida dell'OMS [17].I soggetti che hanno accettato di partecipare allo studio sono stati randomizzati a uno dei tre bracci: AS/MQ, DHA/PPQ o ATQ/PG.I soggetti sono stati trattati con terapia osservata direttamente per 3 giorni e seguiti per un massimo di 42 giorni o fino a evidenza di parassitemia ricorrente.Il protocollo è stato fornito come file aggiuntivo 1.Lo studio è stato condotto presso il Trapeang Prasat Health Center nella provincia di Oddar Meanchey, in Cambogia (Fig. 1).Questo sito si trova in una zona rurale e agricola a circa 8 ore di strada da Phnom Penh.La provincia di Oddar Meanchey si trovava nella zona di contenimento di Fase 2 e il centro sanitario ha partecipato a un programma di sorveglianza per misurare la prevalenza delle mutazioni nei marcatori di resistenza ai farmaci di P. falciparum.I soggetti sono stati reclutati dalle aree intorno al sito dello studio e inclusi se soddisfacevano i seguenti criteri: (1) età ≥ 5 anni, (2) parassitemia di P. falciparum in stadio sanguigno > 1000 ma < 100.000 parassiti asessuali per µL, (3) ascellari temperatura > 37,5 °C o temperatura rettale o timpanica > 38,0 °C, o storia di febbre documentata nelle ultime 24 h, (4) test di gravidanza sulle urine negativo, (5) capacità di deglutire i farmaci per via orale, (6) disponibilità per il follow-up oltre 42 giorni, e (7) consenso informato liberamente fornito.I criteri di esclusione erano: (1) età < 5 anni, (2) infezione mista da Plasmodium vivax), (3) test della gonadotropina corionica umana nelle urine positivo per la gravidanza, (4) storia di epilessia o malattia psichiatrica, (5) conformità ai criteri dell'OMS per la malaria grave [2], (6) gravi condizioni di comorbilità che richiedono il ricovero in ospedale (inclusi, ma non limitati a gravi malattie renali o epatiche, diabete non controllato, infezioni batteriche sistemiche), (7) terapia antibiotica in corso, (8) storia di ipersensibilità a uno qualsiasi dei farmaci in studio, (9) prevede di lasciare l'area nei prossimi 42 giorni o di non essere disponibile per il follow-up programmato, (10) madre che allatta e (11) qualsiasi altra condizione che, a giudizio del medico dello studio renderebbe la partecipazione allo studio non sicura per il potenziale volontario.Sono stati arruolati soggetti idonei e consenzienti;le persone non ammissibili sono state inviate per la terapia di routine in clinica.Uno statistico, altrimenti estraneo allo studio, ha distribuito casualmente carte indicanti uno dei tre regimi in 300 buste numerate in sequenza, che sono state sigillate e firmate.Quando un soggetto ha fornito il consenso informato e si è arruolato nello studio, la busta corrispondente al numero di studio del soggetto è stata aperta da un membro del gruppo di studio.I farmaci sono stati forniti dal Ministero della Salute cambogiano e sono stati dosati secondo le linee guida nazionali come descritto nel protocollo (file aggiuntivo 1).Artesunato-meflochina: una compressa di AS conteneva 50 mg e una compressa di MQ conteneva 250 mg;il dosaggio era basato sul peso (12 mg/kg di AS e 25 mg/kg di MQ) e fino a un massimo di 600 mg di AS e 1250 mg di MQ in totale in 3 giorni.Diidroartemisinina-piperachina: una compressa conteneva 40 mg di DHA e 320 mg di PPQ;il dosaggio era basato sul peso e fino a un massimo di 360 mg di DHA e 2880 mg di PPQ in 3 giorni.Atovaquone–proguanile: una compressa conteneva 250 mg di ATQ e 100 mg di PG;il dosaggio era basato sul peso e fino a un massimo di 3000 mg di ATQ e 1200 mg di PG.Microscopi e tecnici di laboratorio erano in cieco rispetto ai trattamenti ricevuti da ciascun soggetto.I pazienti sono stati osservati in clinica per un'ora dopo ogni dose.Prima di iniziare la terapia, sono stati prelevati fino a 5 ml di sangue venoso per saggi di resistenza ai farmaci in vitro, marcatori di resistenza e studi di genotipizzazione.Ai soggetti è stato chiesto di visitare nuovamente l'unità di studio nei giorni 1, 2, 3, 7, 14, 18, 21, 28, 35 e 42. Ai soggetti è stato inoltre chiesto di tornare in qualsiasi altro giorno in cui si fossero sentiti male per monitorare recupero clinico/recidiva dei sintomi della malaria.Nel caso in cui un soggetto non fosse riuscito a visitare nuovamente l'unità di studio nei tempi previsti, un membro del gruppo di studio ha visitato il soggetto.I fallimenti terapeutici (parassitemia persistente o ricorrente) sono stati trattati con chinino solfato orale 10 mg di sale/kg tre volte al giorno e tetraciclina 1 g al giorno per 7 giorni.Strisci di sangue spessi e sottili sono stati colorati con Giemsa al 10% per 10 minuti ed esaminati da un microscopista certificato utilizzando la microscopia ottica a immersione in olio 1000 ×.Sono stati esaminati almeno 200 campi oculari e il numero di forme asessuali e sessuali per 200 globuli bianchi (WBC) nello striscio spesso è stato registrato separatamente.Questo è stato convertito in parassiti/µL per l'analisi utilizzando un multiplo di conversione di 40 (supponendo 8000 WBC/µL).La sensibilità al farmaco in vitro degli isolati di P. falciparum è stata valutata mediante l'uso di un classico test isotopico di 48 ore [18, 19].Sono state preparate soluzioni madre di farmaci antimalarici (Sigma-Aldrich, Singapore) in metanolo e ulteriori diluizioni seriali doppie in acqua distillata (Biosedra, Francia).Due pozzetti di una piastra Falcon da 96 pozzetti a fondo piatto (ATGC, Francia) sono stati rivestiti con ciascuna concentrazione di farmaco, essiccati e conservati a 4 °C fino al momento dell'uso.I test in vitro hanno utilizzato i ceppi di riferimento 3D7 e Dd2 di P. falciparum con sensibilità ai farmaci nota.I campioni di sangue con una parassiemia di almeno 6400 parassiti asessuati/µl sono stati lavati tre volte con terreno RPMI 1640 (GibcoTM, Invitrogen Corporation, Francia) mediante centrifugazione (800×g, 10 min, 4 °C) e testati direttamente senza adattamento colturale.Gli eritrociti infetti sono stati sospesi (1,5% di ematocrito, 0,1–1% di parassitemia) in terreno RPMI completo integrato con siero umano AB+ decomplementato al 10% (Biomedia, Francia) tamponato con HEPES 25 mM e 11 mM d -(+)-glucosio 25 mM NaHCO3 , contenente [G-3H] ipoxantina (0,5 µCi/pozzetto; Amersham Biosciences, Francia).La miscela è stata distribuita (200 µl per pozzetto) in piastre da 96 pozzetti pre-rivestite con farmaci antimalarici.Ciascuna piastra includeva due pozzetti di controllo senza farmaci e un pozzetto di controllo senza parassiti.Le piastre sono state incubate per 48 ore a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% e quindi le cellule sono state lisate mediante congelamento-scongelamento.Dopo la raccolta su carta da filtro in fibra di vetro utilizzando un raccoglitore di cellule, la quantità di [G-3H] ipoxantina incorporata nella nucleoproteina dei parassiti è stata determinata utilizzando un contatore Wallac MicroBeta Trilux (Perkin Elmer, Francia).Un'approssimazione log probit è stata utilizzata per determinare la concentrazione inibitoria del 50% (IC50), definita come la concentrazione alla quale il 50% dell'incorporazione di [G-3H]ipoxantina è stato inibito rispetto ai pozzetti di controllo privi di farmaci.Il test di resistenza in vitro ha richiesto una parassitemia iniziale di almeno lo 0,1% e non è stato eseguito su campioni con una parassitemia iniziale < 6400 parassiti/µl (160 parassiti/200 leucociti).Le soglie IC50 per la resistenza in vivo a CQ, MQ e QN sono state descritte in precedenza per saggi radioisotopi utilizzando isolati di P. falciparum adattati alla coltura: da IC50 a CQ > 45,5 ng/mL (85 nM), da IC50 a MQ > 10 ng/mL (24 nM) e da IC50 a QN > 275 ng/mL (351 nM) [20, 21].Cinquanta µl di sangue venoso sono stati individuati sulla carta da filtro Whatman n. 1 e conservati singolarmente in sacchetti di plastica con chiusura lampo con essiccante.Le macchie di sangue essiccato sono state tagliate in piccoli pezzi, poste in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml e lisate in 1 ml di acqua sterile per 10 minuti a temperatura ambiente.Durante questa fase, le provette sono state agitate su vortex ogni 1-2 minuti e quindi centrifugate a 4500 × g per 5 minuti.Il supernatante è stato decantato e il precipitato di DNA è stato risospeso in 10 volumi di chelex-100 al 5% (Biorad Laboratories Inc. Hercules, CA) e incubato per 20 minuti a 56 ° C con un breve vortice prima e dopo l'incubazione.Le provette sono state quindi poste in un blocco riscaldante a 100 ° C per 8 minuti e agitate brevemente su vortice dopo l'incubazione.Dopo una centrifugazione finale a 4500 × g per 2 minuti per precipitare il materiale organico legato al chelex, i supernatanti contenenti DNA sono stati rimossi mediante pipetta per l'amplificazione PCR.Macchie di sangue di circa 2 cm di diametro hanno prodotto da 50 a 100 ng di DNA totale.La genotipizzazione per distinguere le nuove infezioni dalle recrudescenze è stata condotta mediante amplificazione delle proteine ​​di superficie 1 e 2 del merozoite (msp1 e msp2) e dei marcatori di proteine ​​​​ricche di glutammina (glurp) su campioni accoppiati ottenuti dai partecipanti il ​​giorno 0 e il giorno del fallimento.Primer progettati per amplificare tre famiglie alleliche dal blocco due di msp1 (K1, MAD20, R033), due famiglie alleliche da msp2 (FC27 e 3D7) e la regione polimorfica di glurp sono stati utilizzati nell'amplificazione e nell'analisi PCR come descritto in precedenza [22] .I prodotti PCR dei campioni accoppiati sono stati caricati uno accanto all'altro.I gel sono stati colorati con bromuro di etidio e visualizzati sotto illuminazione UV.Le dimensioni delle bande dei prodotti PCR attraverso i tre marcatori sono state visualizzate con illuminazione UV.Le dimensioni delle bande dei prodotti PCR attraverso i tre marcatori sono state misurate visivamente e confrontate per campioni accoppiati del giorno 0 e del giorno del fallimento.In accordo con le raccomandazioni dell'OMS, un'infezione ricorrente è stata classificata come infezione ricorrente (fallimento del trattamento) se c'era almeno una banda corrispondente in qualsiasi famiglia allelica per tutti e tre i marcatori [23].Se non c'erano alleli condivisi per almeno un marker, un'infezione ricorrente veniva classificata come reinfezione.Se l'amplificazione non è riuscita per un marcatore, il marcatore non è stato utilizzato per la determinazione della reinfezione e della recrudescenza, ma sono stati applicati i criteri di classificazione sopra indicati per i marcatori che sono stati amplificati.L'analisi dell'amplificazione del gene Pfmdr1 è stata eseguita come descritto altrove [24, 25].Multiplex PCR è stato utilizzato per amplificare i prodotti da entrambi i geni Pfmdr1 e β-tubulina in un'unica provetta.La PCR è stata eseguita in un volume totale di 25 µL contenente il kit Rotor-gene Probe PCR (contenente tampone PCR e HotStarTaq Plus DNA Polymerase), 3,0 mM MgCl2, 300 µM di ciascun deossinucleoside trifosfato, 300 nM ciascun primer Pfmdr1 (primer in avanti: 5' -ttaagttttactctaaaagaagggaaaacatat-3′; reverse primer: 5′-tctccttcggttggatcataaag-3′) con 150 nM di sonda Pfmdr1 etichettata con 5′ Fam e 3′ Tamra (5′-Fam-catttgtgggagaatcaggttgtgggaaat-Tamra-3′) [24], 10 nM di ciascun primer β-tubulina (primer diretto: 5′-tgatgtgcgcaagtgatcc-3′; primer inverso: 5′-tcctttgtggacattcttcctc-3′) con 100 nM di sonda β-tubulina marcata con 5′ Vic e 3′ Tamra (5′ -Vic-tagcacatgccgttaaatatcttccatgtct-Tamra-3 '[25]. Ogni test è stato eseguito in duplicato. Le reazioni sono state eseguite in un sistema PCR Rotorgene real-time utilizzando le seguenti condizioni di ciclo: 95 ° C per 3 min, 50 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 minuto I risultati sono stati accettati come validi se il numero di copie per i campioni di DNA di controllo era 0,8–1,2 per 3D7 e 2.8–3,2 per W2Mef e se la differenza tra i numeri di copie duplicate era < 50% della media.L'efficienza \(E\) , è stata calcolata dalla pendenza di una curva standard composta da diluizioni note di un DNA di riferimento \((E = 10 - 1/pendenza)\).Il numero di copia è stato calcolato come: \(Copy\# = \left( {Ebt*Ctbt} \right)/\left( {Emdr*Ctmdr} \right)\) dove \(Ebt\) e \(Emdr\) sono le efficienze per β-tubulina e Pfmdr1, rispettivamente, e \(Ctbt\) e \(Ctmdr\) sono il numero corrispondente di cicli per raggiungere la soglia.Gli isolati di plasmodio falciparum sono stati sottoposti a screening per le mutazioni del citocromo b Y268 che sono state associate alla resistenza all'atovaquone.In breve, i prodotti PCR esterni (1385 paia di basi) sono stati usati come modelli per due secondi round [26].Per entrambe le PCR nidificate (NsiI e SspI), l'amplificazione è avvenuta nella seguente miscela di reazione: 2,5 mL di tampone, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM ciascun deossinucleoside trifosfato, 0,5 mM ciascun primer (NsiI forward primer: 5′-ggtttacttggaacagtttttaacaatg-3′ , primer inverso NsiI: 5′-ggtttacttggaacagtttttaacaatg-3′, primer in avanti SspI: 5′-acagaataatctctagcacc-3′, primer inverso SspI: 5′-acctgaatggtactttctacaatat-3′), 2 unità di FirePol Taq polimerasi (Solid Biodyne, Estonia) e 2 ml di prodotti PCR.Le PCR nidificate sono state eseguite nelle seguenti condizioni: riscaldate a 94 °C per 5 minuti, seguite da 30 cicli di riscaldamento (94 °C per 30 s, 45 °C per PCR nidificata NsiI o 55 °C per PCR nidificata SspI per 90 s e 72 °C per 2 min) e riscaldata per un periodo di estensione finale a 72 °C per 10 min.Cinque ml di prodotti PCR nidificati, regolati a 500 ng/mL, sono stati miscelati rispettivamente con 0,2 ml di NsiI e 2,5 ml di tampone 3 (per PCR nidificato NsiI) o con 0,2 ml di SspI e 2,5 ml di tampone 2 (per PCR nidificato SspI) secondo le istruzioni del produttore (New England BiolabsH, Francia), incubato per 4 ore a 37 gradi centigradi e inattivato a 65 gradi centigradi (per PCR nidificato SspI) o 80 gradi centigradi (per PCR nidificato NsiI) per 20 min.Le bande sono state rilevate mediante elettroforesi su gel di agarosio standard al 2% e colorazione con bromuro di etidio.I polimorfismi al codone 268 sono stati valutati in base al numero e alla dimensione delle bande: Y268Y (tat) - Polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione NsiI (RFLP) (2 bande: 359 + 25 paia di basi) e SspI (2 bande: 151 + 23 paia di basi );Y268N (aat) - NsiI RFLP (2 bande: 359 + 25 paia di basi) e SspI (1 banda: 174 paia di basi);Y268C (tgt) o Y268S (tct) - NsiI RFLP (1 banda: 384 paia di basi) e Sspl (2 bande: 151 + 23 paia di basi).Le mutazioni al codone 268 sono state confermate secondariamente dal sequenziamento.In breve, i prodotti PCR nidificati sono stati inviati a Macrogen (Seoul, Corea del Sud).Gli elettroforegrammi sono stati visualizzati e analizzati con il software CEQ2000 v2.0 (Beckman Coulter, Francia).Le sequenze di amminoacidi sono state confrontate con la sequenza del ceppo di riferimento 3D7 (PF3D7_MIT02300).Sulla base dell'ipotesi primaria che il limite superiore dell'intervallo di confidenza del 95% per la proporzione di ACPR nei soggetti trattati con AS/MQ sia < 90% e il limite inferiore dell'intervallo di confidenza del 95% per la proporzione di ACPR nei soggetti trattati con DHA/PPQ o ATQ/PG è > 90%, la dimensione del campione target era di circa 100 soggetti per braccio.Sebbene non intendesse determinare la differenza di efficacia tra i bracci, una dimensione del campione di 100 per gruppo ha fornito il 90% di potenza per rilevare la differenza di efficacia del 95% in un regime e dell'80% in un altro.L'analisi primaria era l'efficacia del farmaco, calcolata come percentuale di soggetti che non richiedevano una terapia alternativa durante il corso di 42 giorni dello studio e riportata con intervalli di confidenza del 95% (IC 95%) utilizzando il set di dati per protocollo secondo la raccomandazione dell'OMS [17 ].Inoltre, l'efficacia corretta per PCR è stata stimata dall'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier e i tassi di incidenza dei bracci sono stati confrontati utilizzando il test log-rank utilizzando R versione 4.0.5 [27] e R Studio versione 1.4.1106 [28] utilizzando il seguenti pacchetti: dplyr (versione 1.0.5), survival (versione 3.2–10) e suvminer (versione 0.4.9).Per esaminare le differenze nella suscettibilità ai farmaci parassitari tra 3 regimi, sono stati utilizzati test di Kruskal-Wallis non parametrici per confrontare l'IC50 tra i gruppi.La correlazione tra MQ IC50 e numero di copie Pfmdr1 è stata analizzata utilizzando il test di correlazione del rango di Spearman e il test di Mann-Whitney è stato utilizzato per esaminare la differenza di MQ IC50 tra parassiti con numeri di copie < 1,5 e ≥ 1,5.I test non parametrici di Kruskal–Wallis, della correlazione del rango di Spearman e di Mann–Whitney sono stati eseguiti utilizzando Graph-Pad Prism versione 6.0 (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA).C'erano 211 soggetti che soddisfacevano i criteri per lo studio che sono stati arruolati da ottobre 2009 a novembre 2011 e randomizzati ai bracci AS/MQ (63), DHA/PPQ (77) e ATQ/PG (71) come in Fig. 2. L'arruolamento target di 100 soggetti per braccio non è stato raggiunto a causa della difficoltà di reclutamento.Complessivamente, 171 soggetti hanno completato il follow-up di 42 giorni, mentre 40 soggetti no: 18 (8,5%) a causa di fallimenti e 22 (10,4%) a causa di esclusioni.Dei soggetti esclusi dall'analisi finale, 1 dal braccio AS/MQ è stato escluso a causa di una nuova infezione da P. falciparum;6 sono stati esclusi dal braccio DHA/PPQ a causa della perdita del follow-up (n = 2) e dell'infezione da P. vivax (n = 4);e 15 soggetti sono stati esclusi dal braccio ATQ/PG a causa di allergia (n = 1) e infezione da P. vivax (n = 14).Per l'analisi primaria, sono stati analizzati 189 (89,6%).Le caratteristiche di base erano simili tra i gruppi di trattamento come nella Tabella 1 senza differenze significative nei dati demografici, parassitemia iniziale o presentazione clinica.La maggior parte dei soggetti era di sesso maschile (79,6%) con un'età media di 25,8 anni (range 5-60).La temperatura ascellare media era di 39,6 °C, l'ematocrito medio del 40,7% e la parassitemia media geometrica all'arruolamento era di 11.873 parassiti/µl.La gametocitemia al basale è stata rilevata nel 46,9% dei soggetti.I tassi di ACPR a 42 giorni corretti per protocollo PCR (IC al 95%) per AS/MQ, DHA/PPQ e ATQ/PG erano 80,6% (70,8–90,5%), 97,2% (93,3–100%) e 92,9 % (86,1, 99,6%), rispettivamente.La stima di Kaplan–Meier dell'ACPR corretto per PCR a 42 giorni (IC al 95%) era dell'80,8% (71,6–91,2%) per AS/MQ, 97,3% (93,6–100%) per DHA/PPQ e 94,1% (88,6– 99,9%) per ATQ/PG (Fig. 3).I tassi di ACPR a 42 giorni tra i 3 bracci differivano significativamente dal test log-Rank \(\left( {p = 0,0025} \right)\) .La positività del giorno 3 per le braccia ACT era alta al 57,9%, suggerendo una resistenza all'artemisinina (Tabella 2).Dei 12 fallimenti nel braccio AS/MQ, 10 erano fallimenti clinici tardivi (LCF) e 2 erano fallimenti parassitologici tardivi (LPF);entrambi i fallimenti nel braccio DHA/PPQ erano LCF;e dei 4 fallimenti nel braccio ATQ/PG, 2 erano fallimenti precoci del trattamento (ETF) e 2 erano LCF (Tabella 3).I criteri per ETF, LCF e LPF sono stati descritti nella guida dell'OMS del 2009 in quanto descrive i risultati degli studi sull'efficacia terapeutica seguiti per 42 giorni [29].Stime di sopravvivenza di Kaplan Meier.L'analisi di sopravvivenza di Kaplan Meier è stata eseguita per ciascuno dei tre gruppi di studio per confrontare la sopravvivenza libera da parassiti tra AS/MQ (rosso), DHA/PPQ (verde) e ATQ/PG (blu).I segni di graduazione su ciascuna curva indicano un soggetto censuratoIl numero medio complessivo di copie Pfmdr1 (IC al 95%) al basale era 2,2 (2,0–2,4, Tabella 4).Nel braccio AS/MQ, i fallimenti del trattamento hanno avuto numeri di copie Pfmdr1 più elevati rispetto a quelli con ACPR (3,5 contro 1,8 copie, rispettivamente; \(p <0,00001\) per t-test).I numeri di copie Pfmdr1 misurati al basale e nel giorno della recrudescenza sono elencati per tutti gli errori AS/MQ nel file aggiuntivo 2: Tabella S1.È interessante notare che entrambi i fallimenti del trattamento con DHA/PPQ avevano un numero di copie Pfmdr1 elevato al basale (3,9 copie), ma non alla recrudescenza (1,0 copie).Non c'era differenza nei numeri di copie Pfmdr1 tra ACPR e fallimenti nel braccio ATQ/PG e tutte le recrudescenze erano di tipo selvaggio per le mutazioni del citocromo b.Lo studio è stato condotto prima della scoperta dei marcatori molecolari attualmente riconosciuti della resistenza all'artemisinina e alla piperachina.La resistenza ai farmaci in vitro è stata valutata utilizzando un test isotopico classico per campioni con > 6400 parassiti/µL come in Fig. 4. L'unica differenza statisticamente significativa tra i gruppi è stata osservata per MQ IC50 \(\left( {p = 0,046} \right) \) .L'IC50 medio per MQ, CQ e QN era elevato al di sopra dei loro cut-off di resistenza per ciascun braccio di trattamento in Fig. 4. La resistenza alla meflochina era correlata all'aumento del numero di copie Pfmdr1 (\(r = 0,487\), \(p <0,0001\ ) ) e MQ IC50 era maggiore in quelli con ≥ 1,5 copie (73,5 nM) rispetto a quelli con < 1,5 copie (44,0 nM) al giorno 0 \(\left( {p = 0,0085} \right)\) , come in Fig. 5.Confronto della resistenza ai farmaci parassitari in vitro con i comuni antimalarici.I campioni di 83 isolati di soggetti con > 6400 parassiti/µl sono stati analizzati in un saggio di resistenza ai farmaci in vitro isotopico classico di P. falciparum.La resistenza in vitro è stata calcolata come le concentrazioni inibitorie del 50% (IC50) basate su diluizioni seriali di artesunato (AS), meflochina (MQ), diidroartemisina (DHA), piperachina (PPQ), clorochina (CQ) e chinino (QN).Sono stati utilizzati i cut-off di resistenza stabiliti per i saggi dove noto (MQ, CQ e QN).La resistenza è stata confrontata tra i tre gruppi di trattamento (artesunato-meflochina (A/M) nei cerchi neri; diidroartemisina-piperachina (DP) nei quadrati blu e atovaquone-proguanile (AP) nei triangoli verdiRelazione tra meflochina IC50 e stato Pfmdr1.A Correlazione tra il numero di copie MQ IC50 e Pfmdr1.B Meflochina IC50 era elevato nei parassiti con ≥ 1,5 copie di Pfmdr1In questo studio sull'efficacia terapeutica del 2009-2011 condotto su Oddar Meanchey, i tassi di fallimento corretti per PCR per AS/MQ, ATQ/PG e DHA/PPQ erano rispettivamente del 19%, 6% e 3%.La positività del giorno 3 per i 2 bracci ACT era quasi del 60%, suggerendo un alto livello di resistenza clinica all'artemisinina.Tuttavia, i test di resistenza ai parassiti in vitro su un sottogruppo di campioni non hanno indicato una significativa resistenza all'artemisinina.L'OMS raccomanda di cambiare terapia quando i tassi di fallimento superano il 10% e di istituire misure di contenimento quando la positività al giorno 3 supera il 10% [30].I dati dello studio sono stati forniti al CNM in quel momento e utilizzati per supportare le modifiche alla terapia, inclusa la transizione a DHA/PPQ.Complessivamente, c'erano in media 2,2 copie di Pfmdr1, coerentemente con il lavoro precedente di NAMRU-2 che stimava il numero medio di copie in questo sito a ~ 2. Inoltre, c'erano sia prove in vitro di resistenza MQ che tassi inaccettabilmente alti di AS/MQ fallimenti clinici in questo sito.I fallimenti terapeutici nel braccio AS/MQ avevano un numero di copie Pfmdr1 al basale più alto rispetto a quelli con ACPR (3,5 contro 1,8 copie, rispettivamente).Entrambi i fallimenti del trattamento con DHA/PPQ avevano un'amplificazione Pfmdr1 al basale, ma perdevano l'amplificazione alla recrudescenza.La gametocitemia di base, importante per la trasmissione delle zanzare, è stata la più alta riportata tra gli studi clinici in Cambogia (47%) e superiore alla media globale del 12% in una meta-analisi [31].In questo studio erano presenti alcuni fattori predittivi di gametocitemia basale in Asia (età, sesso maschile e bassa densità di parassiemia) ma non altri (malattia febbrile e anemia) [31].Ciò supporta anche la nozione di infezioni clinicamente covanti nel presente studio indicative di infezioni parzialmente trattate e/o resistenti.Questo studio si è verificato durante la transizione nazionale da AS/MQ e aiuta a colmare il divario storico nella comprensione del passaggio a fallimenti DHA/PPQ conclamati che si sono verificati rapidamente tra il 2008 e il 2014 al confine tra Thailandia e Cambogia.La tabella 5 riassume gli studi clinici sulla malaria da falciparum non complicata in Cambogia dal 2001 al 2018. Una breve rassegna dei risultati storici e provvisori relativi alla resistenza ai farmaci utilizzati nel presente studio è incorporata con una discussione dei risultati.Sebbene alcuni dei marcatori molecolari di resistenza comunemente usati oggi non fossero disponibili, c'era un chiaro aumento del numero di copie Pfmdr1 tra i soggetti con fallimenti AS/MQ, così come MQ IC50 elevati in quelli con numeri di copie elevati.La resistenza all'artemisinina è definita dall'emivita di clearance del parassita (PC1/2) ≥ 5 h, ma una positività al giorno 3 ≥ 10% è considerata un utile surrogato clinico [32].La positività al giorno 3 è aumentata rapidamente (dal 10 al 55%) a Pailin negli studi AS/MQ dal 2004 al 2008. Negli studi DHA/PPQ dal 2008 in poi, la positività al giorno 3 era generalmente più alta nelle province occidentali rispetto a quelle orientali.2018.Emerg Infect Dis.2003.2021.2020.2011.